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谈不同类型试剂盒提取血液基因组DNA效果的比较

  从血液中提取高质量核酸是许多法医和医学诊断的基础,其应用范围包括家畜和人类的HIV、HBV、HCV 和细菌的病原体检测,法医鉴定,诊断疾病(如癌症),遗传性疾病及甲基化研究等。
  由于应用范围较大,用于临床诊断和鉴别的DNA 需求也在不断扩大。DNA 的提取是临床诊断和鉴别准确的基础和关键,DNA 的浓度、纯度和质量是其提取成功的关键。在以往的研究中,基因组DNA的提取和纯化是采用自动化程度较低,且耗时耗力的手工提取法,而试剂盒提取血液DNA 的方法具有简便、高效等优点。随着科学的进步,越来越多的临床研究者选择使用试剂盒或自动提取装置代替传统的手工方法提取血液DNA。目前,最常见的DNA 提取试剂盒的类型主要包括溶液沉淀法、离心柱法和磁珠吸附法试剂盒等。由于不同研究的目的不同,对血液DNA 的要求不同,血液基因组DNA 提取试剂盒类型的选择成为实验顺利进行的关键,但对这几类血液基因组DNA提取方法进行比较的研究较少。因此,本研究对溶液沉淀法、离心柱法和磁珠吸附法试剂盒提取血液基因组DNA 的效果进行比较,为血液基因组DNA提取方案的选择提供依据。
  1 材料与方法
  1. 1 主要试剂及仪器DP319 型血液基因组DNA提取试剂盒、自动磁珠法基因组DNA 提取装置、柱型DNA 提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Midi Kit)及2 × Taq PCR MasterMix 均购自天根生化科技(北京)有限公司;ND-1000 紫外分光光度仪(C1000Touch 型PCR 仪)购自美国Thermo 公司;POWERPAC 3000 型电泳仪和凝胶成像仪购自美国BIORAD公司。
  1. 2 血液标本的制备取本中心高血压患者(均为2006 ~ 2015 年入院,诊室血压在140 / 90 mmHg 以上,且诊断为原发性高血压)空腹静脉全血至少1 ml,加入含EDTA 抗凝剂的聚丙烯管中,立即置-80 ℃保存,避免反复冻融。
  1. 3 血液基因组DNA 的提取随机抽取-80 ℃保存的血标本90 份,置4 ℃冰箱过夜;于37 ℃水浴30 min,充分溶解后,将血液混匀,分别吸取1 ml 用于检测。将血液标本随机分为3 组,分别采用溶液沉淀法(DP319 型血液基因组DNA 提取试剂盒)、离心柱法(QIAamp DNA Blood Midi Kit)和磁珠法(自动磁珠法基因组DNA 提取装置)提取基因组DNA,严格按各试剂盒说明书进行操作,所有提取方法最终均加入200 μl TB 缓冲液对DNA 进行溶解。
  1. 4 基因组DNA 浓度和质量的检测每份DNA样品取2 μl,用无菌水作为空白对照,紫外分光光度计测定基因组DNA 的浓度(ng / μl)、A260 / A280 值及A260 / A230 值,用于评价基因组DNA 的质量。
  1. 5 琼脂糖凝胶电泳检测每份样品取5 μl,加入1 μl loading buffer,恒压120 V 进行0. 7%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像仪观察,并拍照。
  1. 6 PCR 鉴定根据GenBank 中登录的KCNJ5(3762)第2 外显子的核苷酸序列,应用Primer 3. 0软件设计引物,引物序列如下:上游:5′-ACAACCATTGGGTATGGCTTC-3′,下游:5′-AGGCACAGACCTGCATCTTCT-3′,扩增产物大小为466 bp。PCR 扩增体系为:基因组DNA 1 μl(< 1 μg),上、下游引物各1 μl,2 × Taq PCR MasterMix 12. 5 μl,补加dd H2O至25 μl。PCR 反应条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30 个循环;72 ℃再延伸5 min。PCR 产物进行0. 7%琼脂糖凝胶电泳鉴定,方法同1. 5 项。
  1. 7 统计学分析应用SPSS 17. 0 统计学软件进行统计学分析。实验计量资料采用均值± 标准差(x ± s)表示,组间差异首先做正态性分析,若实验数据符合正态分布,采用两两比较的t 检验或方差检验,若数据不符合正态分布,采用非参检验,以P <0. 05 为差异有统计学意义。
  2 结果
  2. 1 基因组DNA 浓度及质量紫外分光光度计检测结果表明,溶液沉淀法、离心柱法和磁珠法提取的血液样本DNA 浓度,差异有统计学意义(P < 0. 001);采用正态性检验不符合正态分布,因此使用非正态分布的非参法进行数据的两两比较,溶液沉淀法提取的DNA 浓度显著高于离心柱法和磁珠法,且差异有统计学意义(P 值分别为< 0. 001 和0. 043),离心柱法和磁珠法提取的DNA 浓度差异无统计学意义(P = 0. 074)。3 种方法提取血液样本基因组DNA的A260 / A280 值及A260 / A230 值的差异均无统计学意义(P 值分别为0. 264 和0. 321)。
  2. 2 琼脂糖凝胶电泳检测结果0. 7 %琼脂糖凝胶电泳分析表明,3 种方法提取的血液基因组DNA 均可见约50 000 bp 的目的条带。磁珠法和溶液沉淀法提取的DNA 点样孔处均有发亮现象,有少量拖尾;离心柱法提取的DNA 点样孔处较干净,电泳条带单一,无拖尾。
  2. 3 PCR鉴定3 种方法提取的基因组DNA 的PCR产物经0. 7%琼脂糖凝胶电泳分析,均可见466 bp的单一且明亮的目的条带。
  3 讨论
  目前,大量临床分子生物学研究需要使用血液基因组DNA 作为基础研究材料,传统的基因组DNA提取的方法较多,如酚氯仿法、异硫氰酸胍法、固相吸附法、盐析法和碘化物法等。许多实验室均已选择使用试剂盒代替手工方法提取血液基因组DNA,每种方法原理不同,操作手法和提取效果也不尽相同。
  一般认为,提取理想的DNA 的方法应快速经济、尽量不含有机溶剂、DNA 质量保证、可用于冷冻标本。本研究选择3 种目前最常见的DNA 提取试剂盒进行血液基因组DNA 的提取,并对3 种方法提取基因组DNA 的效果进行比较。琼脂糖凝胶电泳实验结果显示,3 种方法提取的基因组DNA 相对分子质量一致,离心柱法较其他两种方法提取的DNA点样孔较干净,电泳条带较单一,无拖尾现象,表明离心柱法提取的DNA 纯度高,降解少。紫外分光光度计检测结果显示,溶液沉淀法提取的基因组DNA浓度显著高于离心柱法和磁珠法(P < 0. 05),POH等的研究也证明,溶液沉淀法具有较高的核酸提取量。根据A260 / A280 值可判断DNA 的纯度,A260 /A280 值应在1. 6 ~ 1. 9 之间DNA 纯度较好,(A260 /A280 > 1. 9,表明有RNA 污染,A260 / A280 < 1. 6,表明有蛋白质、酚等污染);A260 / A230 值用来评估样品中是否存在污染物,如碳水化合物、多肽、苯酚等,较纯净的核酸A260 / A230 值应> 2. 0。3 种方法提取的基因组DNA 的A260 / A280 值及A260 / A230 值均在正常范围内,3 组间差异无统计学意义(P > 0. 05),表明3种方法提取的DNA 的纯度均较高,污染均较小。另外,离心柱法和磁珠法消耗的时间相当,分别为1. 6和1. 5 h,在实践操作中发现,磁珠法相对节省人力,但1 次仅能提取1 ml 血样本的基因组DNA,样本量较大时需要重复实验;溶液沉淀法提取DNA 用时较长,为2. 5 h,但提取DNA 浓度相对较高。提取的基因组DNA 是否能进行下游分子生物学实验是本研究的关键。3 种方法提取的DNA 经PCR 检测均得到较好的结果,其PCR 产物条带单一且明亮,表明3 种方法提取的基因组DNA 均可较好地进行下游分子生物学实验研究。
  综上所述,溶液沉淀法、磁珠法和离心柱法DNA提取试剂盒均能满足大多数的分子生物生物学研究,3种提取试剂盒各有优缺点,使用时应根据实际情况选择。如溶液沉淀法提取的DNA 产量相对较高,且可根据每份血液标本量的多少调整用量,适用于需要提取较大量DNA 的研究或实验室血液DNA标本库的建立;磁珠法的优点是提取过程全自动化,且耗时较少,但1 次最多可提取1 ml 血液中的DNA,适合1 ml 及1 ml 以下标本量的研究或需要全自动提取DNA 的研究使用;离心柱法提取的DNA 电泳条带清晰且节约时间,较适合后续实验要求较高或特别需要节约时间的研究使用。